2015年二级公共营养师重点知识：寡糖分离分析技术
寡糖由于单糖分子、寡糖素
结合位置和结合类型的不同，使得种类繁多，功能各异，寡糖的结构与组成直接决定了其生物学功能，鉴于糖缀合物上寡糖链在生命过程中的重要作用，展开寡糖链的结构分析是非常重要的。
糖类的分析方法常规的有苯酚硫酸法、二硝基水杨酸法等化学方法，但是这些方法只能测定总还原糖，不能测定各种糖的含量，且比色定量不准确。混合糖的分离鉴定及其组成的分析方法一般采用纸色谱法、薄层色谱法及柱色谱法，能够在糖类分离的基础上对样品中的各种糖类逐一定量分析，但这些方法存在分离效力有限和非专一性响应的问题，随着现在分析技术的进步，几种先进的物理学方法己经应用到寡糖的分析上来，如气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)和毛细管电泳法(CE)这些方法分离能力高，方法灵敏快速。此外红外(IR)、核磁共振(1H-NMR,13C-NMR,COSY等)、质谱(MS)等方法也运用到了糖类结构分析中，使糖的分析方法有了质的飞跃。以下简要介绍一下这几种方法：
1、气相色谱法(GC)
气相色谱法测定糖类始于1958年，主要用于分析多糖和寡糖的单糖组成。气相色谱法要求供试样品有良好的挥发性和热稳定性，而糖由于含有大量的羟基不能在高温下直接挥发，需要将其衍生为易挥发、对热较稳定的物质。多糖、寡糖可直接制备成衍生物进行GC测定，多糖需先降解成单糖或寡糖后制成衍生物再进行GC测定。在分析复杂样品时，由于糖的异构化而造成多峰现象，所以应选择适宜的衍生物制备方法，常用于糖的衍生试剂有三甲基硅烷、三氯醋酸酐等。
用于糖类分析的固定相从非极性、中等极性到极性都有应用。硅烷化衍生物常用中等极性的色谱柱，酞基衍生物可采用基性较强的色谱柱来分离。对于复杂的多糖，由于其降解产物含有多个峰，且某些峰的保留时间非常接近，人们己越来越多的采用毛细管柱代替填充柱来进行分析。
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2、高效液相色谱法
高效液相色谱(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)法是一种高效率、高分辨率的分离纯化手段。已经成为常量及微量单糖和寡糖重要的分离分析方法之一。
通常采用两种方法：一种是使用化学键合和氨基酸键合的固定相，大多数单糖、低聚糖在氨基柱上可得到满意的分离，但是某些还原糖容易与固定相的氨基发生反应产生希夫碱，使氨基柱的寿命缩短;另一种是离子交换树脂作固定相的离子色谱，水或盐为流动相。根据不同的分离机理，离子色谱可分为离子交换色谱，离子排斥色谱和离子对色谱。用于三种分离方式的柱填料骨架基本上都是苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物。
一般说来，HPLC的光学检测模式可分为直接检测和间接检测两类。然而许多实际样品中所含有的糖是微量的，且自然界存在的大多数糖类物质基本不含有生色基团，因此通过常规的光学检测手段对糖类物质进行高灵敏度的直接检测比较困难，如示差折光检测(RID)的灵敏度和选择性比较低;蒸发光散射检测(ELSD)虽灵敏度有所提高但仍无法满足痕量糖的分析要求。因此，人们通过衍生化将糖类物质转变为具有紫外吸收或可产生荧光的物质,然后再使用LC进行分离分析的间接检测方法，克服了直接检测方法的缺点，实现了高灵敏度检测和痕量分析。
3、毛细管电泳(CE)
毛细管电泳技术不仅是一种分离手段，还可用于寡糖的组成分析、纯度鉴定和结构归属，并对寡糖的酶解产物进行定性和定量分析，从而得到寡糖链的完整结构。但除少数带有羧基和磺酸基的糖类化合物外，绝大多数糖类化合物不带电荷，极性很大，而且没有发色基团或荧光基团，所以对于一般的高效毛细管电泳(HPCE)，可采用以下几种方法使之产生更好效果：如衍生化使之带上发色、荧光基团或电荷;与硼酸盐等络合;与缓冲液中的添加剂形成包含络合物;高pH缓冲条件下使之电离;加入表面活性剂使形成胶束等。随着电泳技术的不断完善，各种衍生化方法和检测技术的出现，使高效毛细管电泳在糖的分离分析中应用越来越广泛。
4、红外光谱(IR)
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上世纪70年代后，由于红外光谱技术的发展以及糖化学研究深入，红外光谱成为糖结构研究重要手段之一。红外光谱是有机化学和高分子化学研究中不可缺少的工具，它可为我们提供官能团及氢键的相关信息。人们经常以多糖的特征吸收峰来鉴定多糖。如840cm-1吸收峰可以判别α-糖苷键的存在，890cm-1吸收峰来判别β-糖苷键的存在。吡喃糖苷在1100～1010cm-1间应有3个强吸收峰。而呋喃糖苷在相应区域只有2个峰。
5、核磁共振(NMR)
自上世纪70年代NMR被引入多糖和寡糖结构的研究，并且发挥着越来越重要的作用，现已成为多糖寡糖结构研究的常规手段。用NMR技术研究糖链结构的优点是不破坏样品。糖链结构特征通过化学位移，偶合常数，积分面积，NOE及迟豫时间等参数表达。高分辨率的1H-NMR能准确测定结构表征基团的化学位移，精度可达0.001ppm。糖链的各种结构特征，均可由这些结构表征基团的微小变化表现出来。13C的天然丰度很低，使得13CNMR的灵敏度低于1H-NMR，后来出现的微型计算机脉冲傅立叶转换方式使得13CNMR能够得到清晰的光谱，使其化学位移范围远较1H-NMR宽，达到200ppm。
二维NMR的出现使得多糖的1H-NMR和13CNMR得到了归属。在糖链的结构分析中，综合运用这些技术可以获得单糖的种类、异头构型、糖苷键位置、非糖取代基位置、单糖连接顺序等一级结构的丰富信息。
6、质谱(MS)
质谱是目前寡糖序列分析的常用方法之一。由于其灵敏度高，药品用量少，在糖分析中得以广泛应用。质谱不仅可用于提供寡糖的分子量信息而且可以确定单糖残基间的连接顺序，近年来，快原子轰击质谱(FAB-MS)、电喷雾电离质谱(ESI-MS)，基质辅助基光解吸质谱(MALDI-MS)、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)在测定糖的分子量和糖链的一级结构方面得到广泛的应用。
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