3. 实验设计
3.1 青钱柳总黄酮的分析与测定
3.1.1 分光光度法测定青钱柳总黄酮[34-38]
青钱柳细粉样品(40目)于60℃干燥4h，精确称取约2g，置于圆底烧瓶中，分别加入乙醇溶液，浸润后，水浴回流，至黄酮类化合物基本提取完全(用三氯化氯显色法检测没有明显的吸光度值)，立即抽滤，收集滤液，置100mL容量瓶中，用乙醇定容，作为样品提取液。
方法一：用移液管精确吸取样液0.5mL于10mL 具塞试管中，加入1mL1%的三氯化铝/甲醇溶液，用甲醇定容，摇匀，放置15 min，以不加样品液为空白在410nm处测定吸光度值。
方法二：用移液管精确吸取样液0.5mL 于10mL 刻度具塞试管中，加60%的乙醇到5mL，加5%亚硝酸钠0.3mL，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝0.3mL，放置6min，加5%氢氧化钠4mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15 min后在500nm处测定吸光度值。
考察两种方法线性关系、精密度、显色稳定性、重现性和加样回收率，得出一种比较适合测定青钱柳总黄酮的方法。
3.1.2 高效液相色谱法分析青钱柳黄酮
微波提取物经初步纯化后进液相检测分析，摸索青钱柳中黄酮类化合物的HPLC分离条件。利用现有标准品对照检测，未知峰利用LC-MS进行初步鉴定。
3.2 青钱柳总黄酮的提取
3.2.1溶剂回流法提取青钱柳总黄酮
选取五个影响因素：乙醇浓度、提取时间、固液比、提取温度、提取次数进行单因素实验之，选出影响显著的四个因素进行正交实验，每个因素选取三个水平，采用正交表L9(34)安排实验。对实验结果进行分析后得出最佳提取工艺参数。
3.2.2微波辅助法提取青钱柳总黄酮
3.2.2.1 单因素实验设计：考察不同乙醇浓度、微波作用时间、固液比、提取温度、提取次数对提取率的影响，实验设计如下：
(1)对固液比的考察：乙醇浓度70%，提取时间5min，提取温度80℃，固液比分别为：1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40，提取1次。
(2)对提取时间的考察：固定乙醇浓度90%，提取温度80℃，固液比为：1:20，提取时间分别为5min、8min、10min、15min、20min、25min，提取1次。
(3)对乙醇浓度的考察：固定提取温度80℃，固液比为：1:20，提取时间为5min，乙醇浓度分别为30%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，提取1次。
(4)对提取温度的考察：固定固液比为：1:20，提取时间为5min，乙醇浓度为70%，提取温度分别为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，提取1次。
(5)对提取次数的考察：固定固液比为：1:20，提取时间为5min，乙醇浓度为70%，提取温度为70℃，提取1次后，滤渣再次按上述步骤进行第2次、第3次……一共提取五次，直到黄酮提尽为止。
3.2.2.2 二次回归通用旋转组合设计
通过单因素实验，得到各影响因素对提取率的影响规律后，选取四个因素为影响因子，以总黄酮提取率为响应值，采用二次回归通用旋转组合设计实验，利用响应面分析法研究各因子与响应值、因子之间的相互关系，进而进行各影响因子的优化研究。
借助SAS软件分析二次回归通用旋转组合设计实验结果，分析得出一个二次回归方程，利用二次回归方程求出微波萃取青钱柳总黄酮的最佳工艺。用SAS软件绘制响应面，用Matlab软件得出响应面的等高线，可直观的分析出各因子与响应值、因子之间的相互关系。
3.3 青钱柳黄酮的分离纯化
先用HPLC分析其粗黄酮的组分，然后采用制备性高速逆流色谱对青钱柳黄酮粗提物进行分离纯化，分部收集，分光光度法测定含量。用HPLC分析收集的组分并检测其纯度。如果收集的组分有很多杂峰纯度不高，再将得到的组分进一步用制备性高速逆流色谱分离，直到得到较纯黄酮单体。
3.4 青钱柳黄酮单体的结构鉴定
通过紫外、红外、核磁和质谱对所获得单体进行结构鉴定。
3.5提取物和黄酮单体的活性实验
分别考察黄酮粗提物和黄酮单体的抗氧化活性，分析青钱柳黄酮起抗氧化活性作用的成分。
4. 研究的可行性
(1) 导师长期从事天然植物活性成分的研究，具有较高的理论水平和丰富的实践经验;
(2) 查阅了大量相关文献和书籍，奠定了理论基础;
(3) 已有类似方法用于其它植物中有效成分的提取和分离纯化，并取得了较好的效果;
(4) 具有黄酮提取、纯化和分析的一般仪器设备条件。
5. 研究中存在的困难
(1) 青钱柳区域专属性特别强，导致外文文献的查找存在困难，可搜索的相关数据库及外文资源很少。
(2) 微波提取、核磁和质谱的试验需到外实验室完成。
6. 预期成果及创新点
预计在国家核心期刊上发表2～3篇论文。主要创新点为：
(1) 建立青钱柳总黄酮的测定方法学(比色法);
(2) 确定微波辅助法提取青钱柳总黄酮的最佳工艺;
(3) 用制备性高速逆流色谱分离纯化青钱柳黄酮;
(4) 考察黄酮粗提物和黄酮单体的抗氧化活性。
7. 研究进展