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1.前言

青钱柳 Cyclocarya paliurus ( Bata1.)Iljinskaja.系双子叶植物纲(Dicotyledoneae)胡桃科(Juglandaceae)植物[1]。青钱柳属高大乔木(10～30m)，花期4～5月，果期7～9月。单数羽状复叶(长约2Ocm)，小叶7～9枚，革质，上面有盾状腺体，下面网脉明显[2]。青钱柳又名青钱李(江西)、山麻柳(四川)、甜茶树(贵州)、一串钱(湖北)等，濒危树种，活化石。主要分布于安徽、江苏、浙江、江西、台湾、湖北、湖南、四川、贵州和云南等地海拔420～2500m 的山区、溪谷或石灰岩山地，在广西桂林、广东东南部等地亦有分布，是福建省山区罕见的速生阔叶树种。江西省农牧厅、省蚕桑茶叶研究所在开展农业资源调查时，发现在江西某山区生活的农民中，有很多长寿老人，发现他们的饮食有一个共同的规律：经常以一种当地特有的植物叶子泡茶饮用，经庐山植物园专家鉴定，该植物其名称为“青钱柳”[3]。据《中国中药志要》记载[4]，青钱柳树皮、树叶都具有清热解毒，止痛功能，可用于治疗顽癣，长期以来民间用其叶片做茶[5]。该茶具有生津止渴、清热解署、降压强心及延年益寿的作用，能增强机体免疫力、抗氧化、防衰老、抗肿瘤等，还可有效地防治糖尿病、高血压、冠心病、神经衰弱等疾病。许多研究人员对青钱柳茶做生物学、药理、治疗毒性等实验后发现青钱柳具有明显的降血糖功效，特别是对Ⅱ型糖尿病有明显疗效[6][7]，因此被称之为“降糖神茶”。

2.课题来源及选题意义

2.1 课题来源

江西省自然科学基金项目 2.2 国内外研究现状

青钱柳的研究起步比较晚，始于20世纪70年代[8]，对其理化成分及保健和药用功效的研究始于20世纪80年代中期。关于青钱柳的资料比较少，主要集中在理化成分、药用价值及饮茶保健功效方面。2O世纪8O年代以来，经国内一些大专院校、科研机构和医院所做的动物及临床实验表明，青钱柳产品确实具有多种对人体有利的生理和药理功能[9]。目前对青钱柳的研究主要集中在国内[10]，日本也有少量学者曾对青钱柳做过研究。

黄酮类成分在人类饮食结构中占有重要的地位，其摄入量与癌症及心脑血管等疾病的发生有着密切的关系。黄酮类化合物具有保肝、扩冠、抗炎、降低血管脆性，解除痉挛，增强心脏收缩，有一定程度的抗菌及抑制肿瘤细胞等作用。同茶叶相比青钱柳中黄酮类化合物含量相对较高，可作为这些物质的补充源[11]。所以对青钱柳黄酮化合物的研究越来越受到人们的重视。但是迄今为止，分离出的黄酮单体化合物并不多，主要有山柰酚(Kaempferol , I) 、槲皮素(Quercetin ,Ⅱ) 和异槲皮苷(Isoquercitrin ,Ⅲ)[12] [13] 。

目前，植物中总黄酮的提取常采用溶剂法，通常用水、乙醇、甲醇或其它极性溶剂;热水一般仅用于提取苷类，由于热水提取出的杂质较多，故不常用。乙醇或是甲醇是提取黄酮类化合物的最常用的溶剂，高浓度的醇(90%～95%)适合提取苷元，60%的醇适合提取苷类。提取次数一般为2～4次，可用加热回流提取或冷浸法，然后将提取液浓缩，可得其粗提物。一般在极性溶剂提取前或提取后，往往用石油醚或乙醚等处理，以除去油脂、色素等杂质[14]。还有其它提取方法，如超声辅助提取法[15]，微波加热辅助提取法[16]，超临界-CO2萃取法[17]等等。但对于青钱柳总黄酮的提取工艺目前还仅限于溶剂回流提取法。

黄酮含量的测定方法有紫外分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法、纸色谱PC和薄层色谱TLC[18]、荧光测定法[19]、原子吸收光谱法、近红外漫反射光谱法、共振散射光谱法、薄层扫描法[20]、单扫示波极谱法[21]等等。紫外分光光度法仪器设备比较简单，操作起来方便快速，且准确性能达到实验要求，所以广泛应用于总黄酮含量的测定。高效液相色谱法(HPLC) 具有分离效果好，准确性好，分析速度快及仪器自动化程度高等特点，尤其适合于挥发性低、热稳定性差、分子量大及离子型化合物的分析，已广泛用于天然产物的分析，成为中草药、食品化学成分或功能因子的纯度鉴定、含量测定和质量监控的常用手段。黄酮类HPLC法分析通常用反相C18 色谱柱，由于黄酮分子中存在酚羟基，流动相中加入少量的酸可改善峰形[18]。其他含量测定方法也有文献报道，但是使用频率不高[20]。

黄酮类化合物分离纯化的方法主要有：(1)溶剂萃取法：利用黄酮类化合物的极性及杂质极性的不同，选用不同溶剂进行萃取，可达到精制、纯化、分离的目的[22]。(2)柱色谱法：柱色谱分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶[23]、聚酰胺[24]及纤维素粉、葡聚糖凝胶[25]、活性炭等。(3)pH梯度萃取法：适合于酸性强弱不同的游离黄酮类化合物的分离[14]。(4)高效液相色谱法：正相固定相的HPLC主要用于分离无羟基、甲基化或乙酰化的黄酮。用反相C18 色谱柱，采用甲醇-水-乙酸(或磷酸缓冲液)或乙腈-水作流动相，既可用于黄酮苷元的分离，又适应于黄酮苷的分离[26]。(4)高速逆流色谱法：是一种新发展起来的色谱技术，它是利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单相流体动力学平衡，使相对移动的互不相溶的两相(一相为固定相，一相由恒流泵连续输入的为流动相) 在螺旋管中实现高效的接触、混合、分配和传递,并按照分配系数的不同依次洗脱而获得分离[54]。在中药有效成份的分离开发方面显示出强大的优势，尤其体现在对黄酮、生物碱、苷类、萜类、多糖、醌类等成份的分离[27] [28] [29] 。

黄酮化合物的结构鉴定：随着科学技术的不断进步，用各种光谱和波谱综合分析黄酮类化合物的结构已取代了原来的化学方法，主要有质谱(MS)、紫外-可见光谱(UV-VIS)、核磁共振氢谱(1H NMR)、核磁共振碳谱(l3C NMR)、二维核磁共振谱(2D-NMR)等方法[26]

这些方法成功的解决了含糖数目较多的黄酮苷中苷键的构型、糖与糖之间的连接顺序、连接位置等一系列结构确定中的棘手问题。结合单晶X-射线衍射法可以获取化合物分子中各原子的坐标，得到化合物中各原子空间的结合位置，为确定分子结构提供直观可靠的立体图形[30]。

据文献报道青钱柳提取物能通过抑制胰脂肪酶活性有效控制脂肪的吸收，从而证明青钱柳能降低血脂水平，促进脂肪代谢，能有效防治一些疾病：如动脉硬化、脑中风、心肌梗塞等[31];青钱柳还能抑制葡萄糖的吸收，降低人体血糖，从而可以预防由高血糖引起的一系列病症[32]。青钱柳提取物还有增强机体免疫力，抗氧化、防衰老、抗肿瘤等作用[3]。这些药理功能归因于青钱柳中含有丰富的天然药用成份，如多糖、黄酮、酚、植物蛋白(小肽) 、皂苷、香豆精、生物碱、甾体、萜类、苷类，有机酸、胡萝卜素、维生素E、咖啡因等化学成分和一些人体必需的微量元素。

目前，一些以青钱柳叶为主要原料的初级保健品已经上市，江西省修水神茶(集团)公司开发梅山牌降糖神茶系列产品和北京东方科文科技发展有限公司推出的东方科文牌青钱柳降糖保健茶系列(片剂、冲剂、胶囊、含片)等。

2.3 课题研究价值

青钱柳是我国重点保护的濒危植物之一[3]。青钱柳树大喜光，幼苗稍耐阴，喜生于温暖、湿润、肥沃、排水良好的酸性红壤、黄红壤之上，适生于湿度较大的环境中。其根系发达，并且是良好的肥料树种，每年有大量的凋谢物，分解速率高，与常绿针叶树种混合造林后，可改善土壤结构，提高土壤肥力，并能充分发挥涵养水源的功能[33] 。现有的青钱柳资源主要是天然林，不仅数量少，而且多零星分布于深山老林和一些自然保护区中[2] 。因此青钱柳具有很高的保护和开发价值。

青钱柳茶具有生津止渴、清热解署、降压强心及延年益寿的作用，可有效地用于防治糖尿病、高血压、冠心病、神经衰弱等疾病，被称之为“降糖神茶” [12]。它的保健价值已被人们所认可。国内已有公司以青钱柳为主原料研制开发出降糖保健产品。对于青钱柳还需要进一步的开发利用，使之在人类健康革命中发挥更多作用。

目前，对于天然产物中黄酮类物质的研究引起国内外极大关注，因此对于青钱柳黄酮的研究也有其重要意义。此课题将为青钱柳的药理作用，保健功能的研究奠定了理论基础。本课题拟采用溶剂回流提取法和微波辅助提取法提取青钱柳总黄酮，用三氯化铝显色法对其含量进行测定，然后采用高速逆流色谱对青钱柳黄酮进行制备性分离，并对纯品进行结构鉴定和活性功能分析。本课题中青钱柳总黄酮的提取、测定、分离纯化的方法和黄酮单体的活性实验均是首次采用。关于黄酮的提取大多采用传统的有机溶剂回流提取法，此方法排污量大、耗时间长，有效成分损失多、提取效率低、成本高，使工业化生产比较困难，而采用微波辅助提取法能弥补这些不足。

本课题为开发青钱柳黄酮成份提供了科学依据，并且为组织培养功能组分、研究功能食品或药品奠定基础。随着对青钱柳中各种活性成分的深层次研究，将会研制开发出以青钱柳为原料的高技术含量的保健产品，必将带来丰厚的社会效益和经济效益。

2.4 主要研究内容

2.4.1 建立青钱柳总黄酮的分光光度测定法

2.4.2 优化溶剂回流提取和微波辅助提取青钱柳总黄酮的最佳工艺条件

2.4.3 拟采用制备性高速逆流色谱分离纯化青钱柳黄酮，得到纯度较高的黄酮组分并对其进行结构鉴定。

2.4.4 考察青钱柳醇提物和黄酮单体的抗氧化活性，确定青钱柳抗氧化活性中起作用的成分。