(三)仪器设备

紫外分光光度计、PB-10酸度计、显微镜、无菌操作台、不灭菌锅、恒温水浴锅、恒温培养箱、电热干燥箱、电子天平、离心机、滴定架、冰箱、无菌注射器电炉以及常见玻璃仪器等。

研究方案

(一) 基本思路

(二)操作要点 1自然发酵[5]

1.1 自然发酵工艺条件确定

1.1.1自然发酵浆水发酵的制备工艺(使用多种发酵蔬菜)：

以芹菜为例： 浆水芹菜工艺流程：芹菜茎一洗净一切段一沸水热烫3 min一按芹菜：面汤一1：1(m/m)入坛一30℃ 1.1.2培养料配方的研究[7]

研究内容包括添加的面汤比例、热烫处理时间、所加蔬菜等因素的实验和感官评价。

(1)面汤稀释比例：将面汤与凉开水按1:0、1:1、1:3和1:5比例稀释，蔬菜沸水热烫3 min，再按蔬菜:面汤=1:1(m/m)的比例装坛，在30℃下发酵,隔1天测定浆水中亚硝酸盐含量的变化。

(2)热烫处理时间：将新鲜蔬菜沸水热烫1 min、2 min、3 min、4 min和5min，冷却后，按菜:面汤(面汤与水的比例为1:1)=1:1(m/m)的比例装坛，在30℃下发酵，隔1天测定浆水中亚硝酸盐含量的变化。

以上试验每个处理重复3次，测定指标取平均值。

1.1.3最适温度

将不同处理的浆水置于20、25、30、35、37、40℃不同温度中进行发酵，在600 nm 处测定吸光值。

1.1.4最适pH(pH 值测定采用pHB - 4p 酸度计)

将不同处理的浆水pH调至 pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的不同pH值梯度系列，发酵一定时间后在 600 nm 处测定吸光值。

以上试验每个处理重复3次，测定指标取平均值。

1.2 不同种蔬菜(10种蔬菜：芹菜、白萝卜、胡萝卜、小白菜、小青菜、油麦菜、黄瓜、山药、西红柿、冬瓜)分别按上述最优方案实验(添加益生元：低聚乳糖、低聚半乳糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、帕拉金糖、低聚龙胆糖、大豆低聚糖、水苏糖、棉籽糖、野芝麻四糖)

以芹菜为例：分为十组实验，分别添加十种益生元(以棉籽糖为例：添加量为0.5%，以水为溶剂配制成100%的溶液)，每种益生元做三组对照试验(其中包含一组空白试验，另外两组平行)，在实验过程中测定亚硝酸盐含量。

以上试验每个处理重复3次，测定指标取平均值。

1.3 浆水中亚硝酸盐的含量测定方法[8](盐酸萘乙二胺法 GB/T 5009.33─2010)

1.3.1试样处理：

将12.5mL 饱和硼砂液加入于5.0mL发酵液中，再加入40mL蒸馏水后沸水浴加热15min，冷却至室温后加入5mL 亚铁氰化钾溶液，再加入5mL 乙酸锌溶液混匀。静置30min 以沉淀蛋白质。将上述液体定容至100mL。过滤后，弃去初滤液5mL，收集剩余滤液备用。

1.3.2亚硝酸盐标准曲线制作：

吸取0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50mL 亚硝酸盐标准使用液( 相当于0、1、2、3、4、5、7.5、10、12.5μg 亚硝酸钠) 分别置于50mL 比色管中，然后分别加入2mL 对氨基苯磺酸溶液( 4 g /L) ，混匀，静置3～5 min 后再加入1mL 盐酸萘乙二胺( 2g/L) ，混匀，静置15min，用2cm 比色皿，以零管调节零点，在波长538nm 处测定吸光度。

1.3.3样品测定：

取2.00mL上述处理液加入40mL水，2mL对氨基磺酸溶液，混匀后避光静置5min，再加入1mL盐酸萘乙二胺溶液后定容至50mL 后，避光静置15min，测OD53 8nm 值，同时以等量蒸馏水做空白对照。

1.4 比较不同蔬菜发酵的浆水中亚硝酸盐含量：

2 人工接种发酵：

2.1人工接种发酵工艺条件确定：

2.1.1人工接种发酵浆水的制备工艺(使用多种发酵蔬菜)： 以芹菜为例： 浆水芹菜工艺流程：芹菜→洗净→切段→沸水热烫 3min→按芹菜:面汤(m/m)=1:1 入坛→分别接入 3%L1、L2、L3和 L4四种单乳酸菌(L1保加利亚乳杆菌、L2嗜酸乳杆菌、L3植物乳杆菌、L4嗜热链球菌 )或接入 3%L1+ L2、L1+ L3、L1+ L4、L2+ L3、L2+ L4、L3+ L4=1:1(v/v)和 L1+ L2+ L3+L4=1:1:1:1(v/v)复合菌种)→30℃下敞口发酵

2.1.2培养料配方的研究

研究内容包括添加的面汤比例、热烫处理时间、所加蔬菜等因素的实验和感官评价。

(1)面汤稀释比例：将面汤与凉开水按1:0、1:1、1:3和1:5比例稀释，蔬菜沸水热烫3 min，再按蔬菜:面汤=1:1(m/m)的比例装坛，在30℃下发酵,隔1天测定浆水中亚硝酸盐含量的变化。

(2)热烫处理时间：将新鲜蔬菜沸水热烫1 min、2 min、3 min、4 min和5min，冷却后，按菜:面汤(面汤与水的比例为1:1)=1:1(m/m)的比例装坛，在30℃下发酵，隔1天测定浆水中亚硝酸盐含量的变化。

以上试验每个处理重复3次，测定指标取平均值。

2.1.3最适温度

将不同处理的浆水置于20、25、30、35、37、40℃不同温度中进行发酵，在600 nm 处测定吸光值。

2.1.4最适pH(pH 值测定采用pHB - 4p 酸度计)

将不同处理的浆水pH调至 pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的不同pH值梯度系列，发酵一定时间后在 600 nm 处测定吸光值。

以上试验每个处理重复3次，测定指标取平均值。

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